Арест Королёва санкционировал помощник Генерального прокурора Андрея Вышинского Марк Рагинский. Постановление на арест писал заместитель наркома внутренних дел СССР Семён Жуковский. Основаниями для ареста явились показания арестованных ранее Ивана Клеймёнова, Георгия Лангемака и Валентина Глушко — все трое называли Королёва соучастником некой контрреволюционной троцкистской организации внутри РНИИ, «ставящей своей целью ослабление оборонной мощи в угоду фашизму». Следствие по делу вели лейтенанты оперуполномоченные НКВД Николай Быков[27] и Михаил Николаевич Шестаков[28][29].

Обвинения были предъявлены по двум пунктам статьи 58: 58-7 — «Подрыв государственной промышленности …, совершённый в контрреволюционных целях путём соответствующего использования государственных учреждений и предприятий, или противодействие их нормальной деятельности» — и 58-11 — «Всякого рода организационная деятельность, направленная к подготовке или совершению предусмотренных в настоящей главе преступлений …». Утверждалось, что с 1935 года Королёв проводил преступную работу по срыву отработки и сдачи на вооружение РККА новых образцов вооружения.

О применении к нему физических репрессий и издевательств следователями сам Королёв утверждал в своём письме на имя Иосифа Сталина от 13 июля 1940 года[30] с просьбой объективно расследовать его дело[31]. Журналист Ярослав Голованов[29][32] подвергал версию, связанную с получением перелома челюсти Королёва в момент его допроса в НКВД, сомнению, так как доказательства по данному факту отсутствуют.

25 сентября 1938 года включён в список лиц, подлежащих суду Военной коллегии Верховного суда СССР. В списке он шёл по первой (расстрельной) категории[33][34]. Список был завизирован Сталиным, Молотовым, Ворошиловым и Кагановичем[35].

Осуждён Военной Коллегией Верховного Суда СССР 27 сентября 1938 года, обвинение: ст. 58-7, 11. Приговор: 10 лет ИТЛ, 5 лет поражения в правах. 13 июня 1939 года Пленум Верховного Суда СССР отменил приговор Военной Коллегии Верховного Суда СССР, а следственное дело по обвинению Королёва было передано на новое расследование, в ходе которого Королёв показал, что данные им показания на следствии в 1938 году не соответствуют действительности и являются ложными.